Олигосахариды грудного молока: функции в организме ребенка и вопросы, требующие изучения

Ларс Боде

Отделение неонатологии и Отделение гастроэнтерологии и нутрициологии, Отделение педиатрии, Университет Калифорнии, Сан Диего, Ла Джолла, США

Серия семинаров Института питания Нестле, том 90, стр. 191-201, 2019.

Олигосахариды грудного молока (ОГМ) являются третьим по количеству компонентом грудного молока. До настоящего времени выявлено более 150 различных и различающихся структурно ОГМ. Состав ОГМ значительно различается у разных женщин, однако остается постоянным в течение всего периода лактации у одной женщины. В настоящее время не совсем понятно, какие именно генетические факторы организма матери и экологические причины определяют индивидуальные различия в составе ОГМ, кроме того, пока неизвестно, действительно ли специфический состав ОГМ формируется у женщины для максимально полного удовлетворения особых потребностей ее собственного ребенка. Для того, чтобы в полной мере оценить многочисленные эффекты, функции и возможность декларирования заявлений, связанных с ОГМ, необходимы доклинические, клинические исследования и исследования с выделением когорт.

В некоторых случаях отдельные ОГМ вызывают определенные эффекты и, несмотря на возможность некоторой избыточности, такого рода эффекты часто в значительной степени специфичны для определенной структуры. В других случаях для получения эффекта необходимо сочетание разных ОГМ в определенных соотношениях, в связи с чем требуется дополнительное изучение для оценки того, является или нет применение только одного ОГМ контрпродуктивным и потенциально опасным для здоровья ребенка первого года жизни в краткосрочной и отдаленной перспективе. В целом, персонализированная сложность ОГМ не может быть воспроизведена в формулах для искусственного вскармливания детей первого года жизни, что является еще одним весомым поводом для защиты, распространения и поддержания практики грудного вскармливания.

В одном литре зрелого грудного молока содержится 5-15 г сложных углеводов, которые называются олигосахаридами грудного молока (ОГМ). Высокая концентрация превращает ОГМ в третий по количеству твердый компонент зрелого молока, в котором содержится большее количество только лактозы и общих липидов, при этом ОГМ часто превышают концентрацию белков [1]. Для сравнения, концентрация олигосахаридов в коровьем молоке от 100 до 1000 раз меньше, и многие олигосахариды коровьего молока в структурном отношении отличаются от ОГМ и являются менее сложными. Несмотря на то, что к настоящему времени выявлено более 150 разных ОГМ, их состав соответствует базовой схеме, предусматривающей соединение пяти строительных элементов, а именно глюкозы (Glc), галактозы (Gal), N-ацетилглюкозамина (GlcNAc), фукозы (Fuc), а также Nацетилнейраминовой кислоты (Neu5Ac), в специфических положениях (Рисунок 1A) [2]. Все ОГМ содержат лактозу (Galβ1- 4Glc) на восстановленном конце. Лактоза может удлиняться в положении C3 Gal либо лакто-N-биозой (Galβ1-3GlcNAc, цепь 1 типа), либо N-ацетиллактозамином (Galβ1-4GlcNAc, цепь 2 типа) Это на первый взгляд незначительное отличие в связи между Gal и GlcNAc может иметь большое значение для переваривания и биодоступности ОГМ. В то время как β1-3 связь в лакто-N-биозе (1 тип) не может быть расщеплена βгалактозидазой (лактазой) кишечника ребенка, связь β1-4 в Nацетиллактозамине (2 тип), скорее всего, является субстратом для фермента. Это указывает на то, что цепь 2 типа такого ОГМ как лакто-N-неотетраоза (LNnT) частично расщепляется в проксимальном отделе кишечника ребенка первого года жизни, не достигает дистального отдела кишечника и толстой кишки, и, следовательно, не доступна для всасывания или утилизации микроорганизмами. Напротив, цепь 1 типа ОГМ, например, лактоN-тетраозы (LNT), не поддается расщеплению лактазой, сохраняется интактной в тонком кишечнике ребенка, может достигать толстой кишки в неизменном виде и быть доступной для всасывания или использования микроорганизмами. В дополнение к удлинению цепи в положении C3 Gal, дисахариды лакто-N-биоза или N-ацетиллактозамин также могут присоединяться в положении C6 Gal, результатом чего является разветвление цепи.

Многократное добавление дисахаридов к растущей цепи приводит к образованию более сложной линейной или разветвленной молекулы ОГМ (Рисунок 1D). Более того, ОГМ могут модифицироваться за счет добавления Fuc к связи α1-2-, α1- 3-, и/или α1-4 и/или добавления Neu5Ac к связи α2-3- и/или α2-6. Каждая молекула Neu5Ac содержит карбоксильную группу и привносит негативный заряд в ОГМ. В результате присоединения Fuc или Neu5Ac к лактозе образуются небольшие трисахариды 2’- фукозиллактоза (2’FL), 3-фукозиллактоза (3’FL), 3’-сиалиллактоза или 6’-сиалиллактоза (Рисунок 1E). Добавление одной или более молекул Fuc и/или Neu5Ac к растущей линейной или разветвленной цепи ОГМ приводит к образованию сложной молекулы ОГМ с потенциально большим количеством отрицательных зарядов, если происходит присоединение более одной молекулы Neu5Ac (Рисунок 1F). ОГМ, содержащие Neu5Ac, часто относят к «кислым».

Хотя состав ОГМ соответствует определенной схеме, и к настоящему моменту описано более 150 различных ОГМ, важно отметить, что в организме каждой женщины синтезируется и секретируется определенный профиль ОГМ, который в значительной степени индивидуален для каждой женщины, однако остается довольно постоянным в течение периода лактации у одной и той же женщины.

Некоторые вариации в составе ОГМ могут быть объяснены генетическими факторами организма матери [1]. Фукозилирование ОГМ, в основном, катализируется двумя разными фукозилтрансферазами, ферментами, которые облегчают присоединение Fuc к оси молекулы ОГМ в различных положениях [3,4]. Фукозилтрансфераза 2 (FUT2) добавляет Fuc к Gal в положении связи α1-2 [5]. Мутации в гене «Секретор», который кодирует FUT2, приводят к инактивации этого фермента и, как следствие, пробы молока так называемых женщин несекреторов имеют очень низкие концентрации α1-2- фукозилированных ОГМ, например 2’-FL или лакто-Nфукопентаоза 1 (LNFP1). Фукозилтрансфераза 3 (FUT3) добавляет Fuc к Gal или GlcNAc в положении связи α1-3- или α1-4, в зависимости от того, относится ли субстрат к 1 или 2 типу цепи [6]. Мутации в гене Льюиса, который кодирует FUT3, приводят к инактивации фермента, и, как следствие, пробы молока от женщин, которые относятся к группе 0 по системе Льюиса, имеют очень низкие концентрации α1-3/4-фукозилированных ОГМ.

Комбинирование активных/неактивных ферментов FUT2 и FUT3 приводит к образованию четырех групп ОГМ [4]: i. Льюисположительные секреторы (активные FUT2 и FUT 3), ii. Льюисположительные несекреторы (неактивные FUT2, но активные FUT3), iii. Льюис-отрицательные секреторы (активные FUT2, но неактивные FUT3), а также iv. Льюис-отрицательные несекреторы (неактивные FUT2 и FUT3). Эти четыре группы различаются по наличию или практическому отсутствию специфических фукозилированных ОГМ, что соответствует феномену, описываемому схемой «все или ничего». Например, 2’FL либо присутствует и является одним из доминантных ОГМ в молоке женщин-секреторов (активные FUT2), или практически полностью отсутствует в молоке женщин-несекреторов (неактивные FUT2). Напротив, вариация ОГМ, которая не зависит от активности FUT2 или FUT3 изучена хуже. Фактически, остается неясным, какие ферменты, отличные от FUT2 и FUT3, участвуют в биосинтезе ОГМ в эпителиальных клетках молочной железы женщины.

Помимо генетических особенностей организма матери и потенциальных эпигенетических факторов, на состав ОГМ также могут влиять факторы, связанные с условиями проживания матери. В ходе недавно проведенного нами экспериментального исследования на мышах было установлено, что концентрации олигосахаридов уменьшаются в тех случаях, когда лактирующая самка получает в качестве питания рацион, богатый жирами, и увеличивается, когда самка испытывает физические нагрузки (неопубликованные данные).

В настоящее время продолжаются исследования, задачей которых является установить, как рацион, физическая активность и другие факторы, связанные со стилем жизни, влияют на состав ОГМ в организме человека. Здоровье матери также может определять состав ОГМ. Предварительные данные позволяют предположить, что на состав ОГМ влияют ожирение или хронические воспалительные заболевания (неопубликованные данные). Кроме того, данные кроссоверного исследования CHILD («Длительный мониторинг развития здоровых детей в Канаде»), проведенного в национальной когорте [7], показывают, что количество детей в семье, в целом, коррелирует с увеличением концентрации ОГМ, при этом не было выявлено связи состава ОГМ с такими факторами как возраст матери, способ родоразрешения или пол ребенка (неопубликованные данные).

После потребления ОГМ остаются устойчивыми к воздействию низкого pH желудка, а также не подвергаются распаду под воздействием ферментов поджелудочной железы и щеточной каемки в тонком кишечнике [8,9]. Исключением, возможно, являются цепи 2 типа, где терминальная часть β1-4-связанного Gal может быть отделена ферментом лактазой. Примерно 1% потребленных ОГМ абсорбируется и может быть измерено в системном кровотоке и моче [10-13]. Это показывает, что воздействия ОГМ распространяются не только на кишечник, но и другие ткани и органы. Большинство ОГМ достигают дистального конца тонкого кишечника и толстой кишки в неизменном виде, там они либо метаболизируются микроорганизмами, либо выводятся с фекалиями.

ОГМ являются метаболическим субстратом для специфических и потенциально полезных бактерий в кишечнике ребенка первого года жизни [14-16], что делает их первыми пребиотиками, с которыми сталкивается организм человека в раннем периоде развития – когда ребенок первого года жизни находится на грудном вскармливании (Рисунок 2A). Однако последние данные исследований ex vivo позволяют предположить, что пребиотические эффекты разных ОГМ не являются взаимно заменяемыми и действительно определяются структурными особенностями (неопубликованные данные). Состав сообществ микроорганизмов, выделенных из проб фекалий ребенка и культивируемых в анаэробных условиях, изменяется с течением времени в зависимости от того, какие именно ОГМ добавляют в культуру. Например, состав сообщества микроорганизмов очень отличается в условиях добавления либо смеси ОГМ, выделенных из объединенных проб молока, либо отдельных ОГМ, таких как 2’FL или LNT. Поскольку различия в составе и активности сообществ микроорганизмов ассоциируются с такими заболеваниями как ожирение, диабет, воспалительное заболевание кишечника или аутизм, воздействие на организм ребенка отдельного ОГМ, содержащегося в формуле, вместо сложной смеси ОГМ в грудном молоке, может увеличивать риски развития заболеваний. Для исключения этого потенциального риска, а также чтобы избежать возможного причинения вреда здоровью ребенка первого года жизни как в краткосрочной, так и отдаленной перспективе, необходимы исследования, предусматривающие длительные контрольные наблюдения.

Однако ОГМ представляют собой нечто большее, чем просто «пищу для микробов». ОГМ могут оказывать непосредственно бактериостатическое или бактерицидное воздействие (Рисунок 2B). Например, ОГМ тормозят рост Streptococcus agalactiae (группа B Streptococcus; GBS) [17], эти микроорганизмы являются главным патогеном, вызывающим инвазивные бактериальные инфекции у новорожденных, обычно с вертикальным типом заражения в процессе родов, что является процессом, вторичным по отношению к колонизации кишечника вагинальной микрофлорой матери. Передача GBS новорожденному связана с риском таких заболеваний как пневмония, септицемия, а также менингит [18- 20]. Многомерная хроматография позволила обнаружить, что бактериостатический эффект связан со структурой, и что LNT является наиболее эффективным веществом. Скрининг в библиотеке мутантов транспозона GBS показал, что гликозилтрансфераза GBS является одной из мишеней ОГМ. Еще более интригующим является синергия эффектов ОГМ и обычных антибиотиков, таких как ванкомицин и ципрофлоксацин, что имеет большое значение в контексте такой проблемы как активно развивающаяся резистентность к антибиотикам [17].

ОГМ также проявляют антиадгезивные эффекты (Рисунок 2C). Многим патогенам для пролиферации и возможности проникновения в ткани организма-хозяина требуется прикрепление к поверхности эпителия. Процесс прикрепления часто облегчается за счет воздействия поверхностных молекул патогена, которые присоединяются к гликановым структурам на поверхности эпителиальных клеток, известным как гликокаликс. ОГМ и гликаны на поверхности эпителиальных клеток обладают общими структурными чертами, что позволяет ОГМ мимикрировать под поверхностные эпителиальные гликаны и выполнять функции ложных рецепторов. Патогены, вместо связывания с поверхностью эпителиальных клеток и провоцирования заболевания, связываются с растворимыми ОГМ, играющими роль ложных рецепторов, и вымываются после прикрепления, не причиняя вреда. К примерам антиадгезивных эффектов ОГМ относятся бактериальные патогены, такие как Campylobacter jejuni [21] или энтеропатогенные E. coli (EPEC) [22], а также протозойные паразиты, такие как Entamoeba histolytica [23].

ОГМ также могут оказывать прямое воздействие на эпителиальные клетки, не зависящее от микроорганизмов, но влияющее на них опосредованно (Рисунок 2D). Например, эпителиальные клетки мочевого пузыря после воздействия ОГМ становятся значительно более устойчивыми к уропатогенной инвазии E. coli и цитотоксичности [24]. ОГМ также могут изменять реакции иммунных клеток, локально в кишечнике или на системном уровне (Рисунок 2E).

В заключение следует отметить, что ОГМ действуют опосредованно в организме ребенка первого года жизни за счет изменений сообществ микроорганизмов, например, выполняя функции пребиотиков, антимикробных препаратов или веществ, препятствующих адгезии патогенов, а также непосредственно, например, изменяя ответные реакции эпителиальных или иммунных клеток. Кроме того, могут существовать многие другие механизмы действия ОГМ, которые еще не описаны. В целом, арсенал эффектов ОГМ представляется важным в контексте обеспечения здоровья или развития болезни.

Результаты исследований на культурах тканей, экспериментов на животных или клинических исследований с участием женщин, где предусмотрено выделение когорт, позволяют предположить, что ОГМ оказывают положительное воздействие на организм ребенка, получающего грудное молоко. Однако результаты многих подобных исследований ставят на повестку дня дополнительные вопросы. Насколько релевантны результаты, полученные в исследованиях in vitro или в экспериментах на животных? Насколько сходны клеточные линии и ткани в организме ребенка? Насколько сопоставимы эксперименты на животных с учетом особенностей анатомии, физиологии и патофизиологии человека? Насколько значимы ассоциации между ОГМ и итоговыми показателями развития ребенка в исследованиях с выделением когорт по изучению человека? Являются ли наблюдаемые ассоциации истинными причинноследственными связями? Скорее всего, ни одно исследование не сможет дать исчерпывающий ответ на эти вопросы. Напротив, для полной оценки многочисленных эффектов, функций ОГМ, а также обоснования заявлений, связанных с действием ОГМ, необходима реализация тщательно спланированной поисковой стратегии, сочетающей доклинические исследования в культурах тканей и эксперименты на животных, клинические исследования с анализом данных когорт, и, наконец, клинические интервенциональные исследования. Выполненная нами недавно работа по изучению некротизирующего колита (NEC) служит примером того, как сочетание доклинических исследований и исследований с участием человека с анализом когорт может стимулировать проведение клинических интервенциональных исследований для проверки гипотезы, что ОГМ вносят вклад в положительные эффекты кормления грудным молоком.

NEC является одним из самых распространенных и фатальных желудочно-кишечных заболеваний у недоношенных детей [25]. Примерно у 5% всех детей с очень низким весом при рождении (VLBW) развивается NEC, при этом смертность достигает более 25%. В то время как дети, находящиеся на искусственном вскармливании, подвергаются в 6-10 раз более высокому риску развития NEC [26], защитные механизмы, обеспечиваемые грудным вскармливанием, до сих пор изучены недостаточно. В отличие от формул для искусственного вскармливания, грудное молоко содержит большое количество ОГМ.

Кроме того, превентивный эффект донорского молока против NEC сохраняется даже после пастеризации, процесса, который разрушает и инактивирует многие биологически активные компоненты грудного молока, но при этом ОГМ остаются интактными и сохраняют активность. На основании этих наблюдений мы выдвинули гипотезу, что ОГМ влияют на снижение встречаемости развития NEC у детей первого года жизни, получающих грудное вскармливание, а также проверили гипотезу в эксперименте на новорожденных крысах [27]. Новорожденных крысят либо оставляли с самкой, и в этом случае они служили контрольной группой «получающей грудное вскармливание», либо отнимали от самки и кормили формулой перорально и принудительно. В то время как все крысята, которых кормила самка, выжили после 4 дней, только ~75% крысят из группы получения формулы остались в живых. Однако, 95% крысят выживали, если они получали формулу, обогащенную ОГМ, выделенными из объединенных проб молока. Это значительное увеличение выживания совпадало с уменьшением количества патологических наблюдений, как макроскопических, так и микроскопических. Затем мы применили метод многомерной хроматографии для разделения разных ОГМ сначала по заряду, затем по размеру, и идентифицировали один специфический ОГМ, дисиалиллакто-N-тетраозу (DSLNT), содержащий две молекулы Neu5Ac, который и вызывал полезные эффекты. Удаление с помощью фермента всего лишь одной Neu5Ac приводило к полной утрате функций. Это показывает, что эффект в значительной степени зависит от структуры [27].

В то время как полученные данные производят благоприятное впечатление, ценность имеющихся доклинических моделей исследований NEC на грызунах или поросятах можно считать ограниченной [28]. Животные подвергаются внешнему гипоксическому и/или гипотермическому воздействию, которое является не вполне естественным, кроме того, использование животных само по себе можно считать недостатком по причине межвидовых различий в развитии желудочно-кишечного тракта, анатомии и физиологии. Таким образом, продвижение возможных препаратов типа DSLNT на основании противоречивых результатов доклинических исследований сразу в клиническую практику несет в себе чрезвычайно высокий риск получения неудачных исходов лечения. Чтобы сократить разрыв между экспериментами на животных и клиническими интервенциональными исследованиями, мы использовали промежуточный подход и провели многоцентровое клиническое проспективное исследование с выделением когорт и участием матерей и их детей из группы VLBW, которые получали, преимущественно, грудное молоко [29]. Исследование основывалось на наблюдении, что у некоторых детей первого года жизни развивается NEC несмотря на преимущественное кормление грудным молоком. Поскольку состав ОГМ характеризуется индивидуальной вариабельностью, это привело нас к предположению, что дети, у которых развивается NEC, получали молоко с меньшим содержанием DSLNT, чем дети, у которых не было зафиксировано NEC. В наше исследование было рекрутировано 200 матерей и их детей с очень низким весом при рождении, которых кормили, преимущественно, грудным молоком. Мы проанализировали состав ОГМ в грудном молоке, которое получали дети в течение первых 28 дней после рождения, сравнили каждый случай NEC с пятью контролями, а также использовали логистическую регрессию и общее уравнение, чтобы показать, что концентрации DSLNT были значительно меньше почти во всех пробах молока во всех 8 случаях NEC по сравнению с контролями. Фактически, количество DSLNT позволяет определить случаи NEC до того, как будут заметны признаки заболевания. Совокупная оценка DSLNT в течение нескольких дней позволила еще четче разделить случаи NEC и контроли, что позволяет считать содержание DSLNT в грудном молоке потенциальным неинвазивным маркером для идентификации детей из группы риска развития NEC. В то время как только данные по ассоциациям в когортах могут сопровождаться вопросами относительно причинноследственной связи, сочетание этой информации и данных доклинических исследований существенно повышает уверенность в том, что наблюдаемые эффекты действительно связаны с DSLNT, что снижает риск неудачи клинического интервенционального исследования.

В целом, проект изучения NEC является примером того, как сочетание доклинических данных и результатов, полученных в клинических исследованиях с выделением когорт, может стимулировать и направлять клинические интервенциональные исследования (Рисунок 3). аналогичный подход использовался в прошлом для того, чтобы выявить связь ОГМ со снижением встречаемости инфекции, вызываемой Campylobacter jejuni, и диареей [21,30], и используется в настоящее время для изучения влияния ОГМ на состав тела ребенка и риск детского ожирения, а также риск развития аллергии и астмы.

Применив описанный комбинированный подход, мы узнали, что иногда отдельные ОГМ являются эффективными, и эти эффекты обычно зависят от структуры и дозы. Лежащие в основе механизмы, скорее всего, опосредованы специфическими рецепторами на клетках тканей организма-хозяина (в данном случае ребенка) или микроорганизмов. В других случаях для достижения эффекта необходимо сочетание разных ОГМ в определенных соотношениях. Эффекты, скорее всего, опосредуются через формирование сообществ микроорганизмов или непосредственно через скоординированное взаимодействие разных ОГМ с многочисленными различными рецепторами или даже разными типами клеток, например иммунной системы. В ситуациях, когда относительная представленность многих разных ОГМ значит больше, чем присутствие какого-либо одного специфического ОГМ, возникает вопрос, действительно ли специфический состав ОГМ в грудном молоке женщины сформировался для удовлетворения потребностей именно ее ребенка. В этом случае ОГМ можно рассматривать как еще один пример индивидуализированного питания в раннем периоде жизни, помимо других персонализированных компонентов грудного молока, таких как антитела, микробиота молока, иммунные клетки, а также клетки-предшественники. Фактически, индивидуальная сложность ОГМ является дополнительным доводом в пользу защиты, продвижения, а также поддержки практики грудного вскармливания.

Автор заявляет, что исследование было проведено без каких-либо коммерческих или финансовых отношений, которые можно считать потенциальным конфликтом интересов.