Анализ состава и метаболизм олигосахаридов грудного молока у детей первого года жизни

Статьи, зарегистрированные в Medline/Pubmed, опубликованные в отчетах по семинарам Института Питания Нестле (NNI) и материалах Нестле

Мы активно развиваем науку о питании и поддерживаем профессионалов системы здравоохранения во всем мире, начиная с 1981 г.

Анализ состава и метаболизм олигосахаридов грудного молока у детей первого года жизни

Клеменс Кунц^a, Сильвия Рудольф^a,b

^aИнститут нутрициологии и b Отделение педиатрии, Гиссенский Университет Юстуса Либиха, Гиссен, Германия

Серия семинаров Института питания Нестле, том 88, стр. 137–147, 2017.

Можно считать настоящим успехом то, что сегодня нам доступны биотехнологические методы, позволяющие производить достаточные количества некоторых олигосахаридов грудного молока (ОГМ) со степенью чистоты, необходимой для проведения исследований метаболизма и функций этих веществ даже у человека. Недавно были получены данные, указывающие на существование связи между группой крови по Льюису и статусом секретора, а также определенными воспалительными заболеваниями. В этой связи в данной работе подробно рассматриваются вопросы, связанные с метаболическими преобразованиями компонентов, характерных для секреторов и людей с разными группами крови по Льюису. Мы пришли к выводу, что не существует простой схемы выведения из организма ОГМ с мочой или фекалиями, хотя по особенностям состава мочи во многих случаях можно судить о принадлежности матери к «секреторам» или «несекреторам». Тем не менее, отдельные ОГМ характеризуются определенной спецификой, что заслуживает особого внимания. Вариабельность состава экскрементов гораздо выше, чем мочи, что может быть связано с различиями микробиоты кишечника ребенка первого года жизни. Ранее существовала точка зрения, что с течением времени происходит постепенное снижение выведения ОГМ, однако это представление не подтвердилось, так как даже после 7 месяцев исключительно грудного вскармливания интактные ОГМ часто обнаруживаются в фекалиях и моче. Кроме того, было установлено присутствие LNT, основной структуры ОГМ, во всех случаях обнаружения олигосахаридов в фекалиях. Следовательно, полученные нами данные не подтверждают гипотезу о том, что LNT является предпочтительным субстратом для развития микробиоты.

Уже примерно в 1900 г., одновременно с открытием лактобактерий и бифидобактерий, а также их значения для обеспечения здоровья и развития заболеваний, педиатры поняли, что микробиологический состав проб фекалий детей, получающих грудное и искусственное вскармливание различается. Наблюдения показали, что это различие было связано, главным образом, с углеводной фракцией молока. данный факт стал отправной точкой исследований, посвященных изучению углеводов грудного молока. В середине прошлого века Ричард Кун (Richard Kuhn), работавший в Гейдельберге (Германия) впервые обнаружил олигосахариды грудного молока (ОГМ) [1]. В то же время, исследования Пола Гьерджи (Paul György) в Гейдельберге и позднее в Филадельфии (США) были сосредоточены на изучении различных ОГМ в контексте их связи с ростом бифидобактерий в грудном молоке (Рис. 1) [2]. В ходе исследований было описано примерно 150–200 отдельных ОГМ.

В последние годы произошло впечатляющее увеличение объема наших знаний о специфических эффектах ОГМ [3–10]. Уже опубликованы результаты первых исследований по изучению формул для искусственного вскармливания, обогащенных отдельными ОГМ, в которых участвовали дети [11, 12]. Для того, чтобы определить, какой компонент (ы) наиболее оптимальны для обогащения, в каких концентрациях и сочетаниях, а также как долго следует их применять, необходимы исследования по изучению метаболических преобразований ОГМ, их местных и системных эффектов.

Прямой стратегией исследования метаболизма ОГМ является определение наличия или отсутствия олигосахаридов грудного молока в фекалиях, крови, моче или тканях. Однако некоторые обстоятельства препятствуют реализации этого простого подхода: например, образцы ткани и крови невозможно или очень трудно получить при обследовании детей первого года жизни. Кроме того, не удается преодолеть методологические сложности обработки большого количества проб, в связи с чем требуется разработка стандартизированных методов.

В данной статье мы сначала кратко остановимся на сложностях, возникающих при анализе состава ОГМ, после чего будут рассмотрены метаболические аспекты по материалам разных исследований, целью которых было изучение процесса выведения олигосахаридов с фекалиями и мочой.

На сегодняшний день еще не разработаны стандартизированные методы для рутинного анализа, и именно это является одной из основных проблем, обусловливающих получение несоответствующих друг другу качественных и количественных данных, публикуемых в материалах разных исследований. Для идентификации ОГМ недавно начали применять разные методы, такие как хроматография на бумажной подложке, жидкостная хроматография высокого разрешения (HPLC) в сочетании с масс-спектрометрией (MS), HPAEC-PAD (ионнообменная хроматография высокого разрешения), HPLC/чип MS, капиллярный гель-электрофорез/методы лазерной индукции флуоресценции, или жидкостная хроматография-HPLC-MS. Все эти методы позволяют детально изучать паттерн олигосахаридов в отдельных пробах молока, часто наряду с более подробной информацией об относительном количестве отдельных изомеров. Однако большая часть этих методов требует сложной и длительной подготовки, что является препятствием для проведения анализа большого количества проб.

Несмотря на последние методологические достижения, позволяющие описать следовые количества ОГМ и продуктов их распада в биологических пробах, высокая степень структурного разнообразия ОГМ осложняет получение ответа на вопрос «Какие структуры важны для здоровья детей первого года жизни?».

Исследования по изучению метаболизма могут помочь определить, действительно ли ОГМ всасываются и утилизируются в организме ребенка. Более того, профиль олигосахаридов в фекалиях может служить маркером здоровья кишечника детей первого года жизни по причине известной связи между микробиотой и количеством сложных гликанов в кишечнике. Мониторинг выведения с мочой может дополнить наблюдения, проведенные в ходе исследований, посвященных изучению системных эффектов олигосахаридов.

Только недавно были опубликованы результаты научных работ, цель которых заключалась в том, чтобы попытаться доказать наличие прямой связи между структурами ОГМ и их пребиотической функцией in vivo у детей первого года жизни. Недавнее исследование для подтверждения концепции выявило связь между составом фекальных ОГМ и микробиотой кишечника у 2 детей, находящихся на грудном вскармливании, в течение определенного периода времени, хотя оба параметра значительно различались у обоих детей [19]. В другом исследовании была показана связь между фекальным микробиомом детей, находящихся на исключительно грудном вскармливании, и составом ОГМ молока, которое использовалось для кормления [20].

Что касается количественных аспектов, данные различных лабораторий в значительной степени варьируют [13–17]. Часто применяются разные методы MS, кроме того, концентрации приводятся в виде относительных величин. Однако, MS вряд ли можно рекомендовать для количественного анализа, при этом интерпретация таких данных требует осторожности [18]. Помимо прочего, такой анализ связан с необходимостью получения производных, например, путем перметилирования или мечения флуоресцентными реагентами, что делает исследование громоздким. Из-за сложностей количественного анализа эффективность преобразований необходимо доказывать после каждого этапа исследования. Кроме того, следует учитывать тот факт, что часто требуется длительный процесс обработки пробы с различными этапами центрифугирования и/или экстракции с использованием разных картриджей перед тем, как проба сможет быть изучена на приборе MS. Результативность требований, применяемых к исследованию, может отличаться, например, в зависимости от индивидуальных предпочтений или особенностей лаборатории. Вышеуказанные проблемы, безусловно, нуждаются в срочном решении.

Ввиду значительных различий по таким показателям как профиль ОГМ и состав микробиоты, только результаты четко спланированных исследований по изучению структуры и функции могут помочь понять, как ОГМ и микробиота связаны со здоровьем и болезнью.

Первые исследования фекальных олигосахаридов и возможных метаболитов ОГМ у детей первого года жизни были опубликованы группой Лундблада (Lundblad) в 1970-х годах [21]. Последние исследования, в которых применялись новые технологии, проводились либо с участием небольшого количества детей первого года жизни, либо базировались на данных недоношенных детей, функция кишечника которых может очень существенно отличаться от здоровых доношенных детей [22, 23].

Имеющиеся на сегодняшний день данные позволяют сделать вывод, что основная часть ОГМ достигает нижних отделов желудочно-кишечного тракта, где они могут использоваться как питательные вещества разными микроорганизмами, или могут влиять на активность микрофлоры. Оставшиеся количества выводятся в неизменном виде или в виде метаболитов с фекалиями или мочой. На основании этих сведений можно предположить, что не существует единого метаболического процесса для всех ОГМ [5, 24, 25].

На Рисунке 2 представлены примеры, связанные с потреблением, метаболизмом и потенциальными функциями ОГМ, обсуждаемыми в настоящее время.

Для дополнительного улучшения заменителей грудного молока с целью обеспечения максимального эффекта ОГМ часто поднимается вопрос о том, сколько отдельных компонентов следует добавлять в формулы. В этом контексте следует отметить, что, по результатам некоторых исследований, необходимо различать молоко, которое появляется после срочных и преждевременных родов, поскольку считается, что в последнем случае молоко содержит больше ОГМ. То есть, паттерн состава ОГМ в молоке, образующемся после преждевременных родов, отличается от молока, которое вырабатывается после срочных родов [15, 23].

Как уже указывалось, мы не обнаружили различий по общему количеству ОГМ между молоком, которое образуется после срочных и преждевременных родов, ни при изучении молозива, ни при исследовании переходного или зрелого молока. Пример состава зрелого молока приводится на Рисунке 3 a [16].

Однако часто при обследовании большой группы проб не проводится различия между молоком, которое вырабатывается в организме женщин-секреторов и несекреторов, этот аспект обсуждается далее.

В течение длительного времени отмечалось, что паттерн ОГМ зависит от генетики матери, то есть, группы крови по Льюису и статуса секретора или несекретора (Таблица 1) [26, 27]. Этот аспект особенно важен, так как кормление ребенка молоком с другим паттерном ОГМ может снизить или увеличить риск развития определенных заболеваний.

При анализе одной группы проб молока, образующегося после срочных и преждевременных родов (Рисунок 3 a), с учетом статуса секретора/несекретора и группы крови матери по Льюису, становится очевидно, что существуют значительные различия между пробами молока (Рис. 3 b, c). Различия между отдельными ОГМ в обеих группах, а также группах крови по Льюису a, b и негативными пробами по Льюису, рассматриваются более подробно в работе Kunz et al. [16].

Мы провели 2 исследования с применением стабильных изотопов для анализа молока, фекалий, мочи, а также проб дыхательного теста при каждом акте сосания в течение периода до 36 ч после применения перорального болюса с 13 C-меченой глюкозой или галактозой, которую давали матерям в период лактации [28–31]. Далее представлены некоторые результаты наряду с данными, полученными в 2 других исследованиях с выделением когорт [16, 32].

Наши данные подтверждают вывод о том, что общий паттерн нейтральных олигосахаридов в моче детей, находящихся на грудном вскармливании, отражает паттерн молока матери, что указывает на значимую корреляцию с группой крови матери по Льюису и фенотипом секретора. Основное различие между молоком матерей с группой крови по Льюису a, b и 0,  это довольно сложный паттерн молока «Льюис b» по сравнению с «Льюис a» и «Льюис ноль» [25, 31, 32, 33]. При сопоставлении паттерна ОГМ молока «Льюис a» или «Льюис b» с паттерном олигосахаридов мочи этих же детей, наблюдался сходный паттерн с теми же значениями молекулярных масс [25, 30, 31].

Используя метод MALDI-TOF (матрично-активированная лазерная десорбция/ионизация)-MS, можно было визуализировать различия по интенсивности сигнала при изучении как молока, так и мочи, хотя массы m/z 730 (LNT, LNnT), 876 (монофукозилированная LNT/LNnT), или 1022 (дифукозилированная LNT/LNnT), как и другие, присутствовали во всех пробах. Поскольку лакто-N-фукопентаоза (LNFP) I характерна для молока «Льюис b», можно было бы ожидать, что m/z 876, основной сигнал массы, соответствует этому компоненту; однако, при помощи MS нельзя точно установить соответствие различным изомерам. При проведении анализа фракции с помощью HPAEC с пульсовой амперометрической детекцией, что позволяет отделить ОГМ изомеры, такие как LNFP I и II, мы не смогли выявить LNFP I ни в одной из изученных проб мочи от детей, получавших молоко матерей «Льюис b» [25, 31].

Более того, можно было бы ожидать, что специфичные для статуса секретора ОГМ присутствуют только в фекалиях или моче детей первого года жизни, которых кормили молоком от «матерей-секреторов» или «Льюис b». Однако мы обнаружили специфичные для статуса секретора олигосахариды 2’FL, DFLT, а также LNDFH I, не только в моче и фекалиях детей, получавших молоко от матери секретора, но часто, в том числе, у тех детей, которых кормили молоком женщины несекретора [25]. Эти данные соответствуют отчетам исследований Лундблада (Lundblad [21]) по изучению фекалий и Де Леоз с соавторами (De Leoz et al. [35]) по изучению мочи.

Кроме того, и в противоположность другим публикациям, мы выявили LNT и LNnT, 2 структуры обычно обнаруживаемые в грудном молоке, в пробах мочи многих младенцев. Примечательно, что LNT и LNnT были обнаружены во всех пробах фекалий, где присутствовали ОГМ. Однако в других отчетах по исследованию фекалий было отмечено отсутствие LNT в пробах детей, находящихся на грудном вскармливании, в разные моменты времени [22, 35].

Можно сделать вывод, что не существует простого паттерна выведения ОГМ с мочой или фекалиями, хотя особенности выведения с мочой часто соответствуют статусу секретора или несекретора матери. Тем не менее, особого внимания заслуживают явные расхождения по некоторым отдельным ОГМ. Вариабельность содержания ОГМ в фекалиях гораздо выше, чем в моче, причиной этого может быть вариабельность состава микрофлоры желудочно-кишечного тракта. Простого постепенного снижения выведения ОГМ с течением времени, как предполагалось ранее, не происходит, так как даже после 7 месяцев исключительно грудного вскармливания могут выявляться интактные ОГМ, хотя у большинства детей первого года жизни олигосахариды не обнаруживаются. Кроме того, мы установили присутствие LNT, основной структуры ОГМ, во всех случаях обнаружения олигосахаридов в фекалиях. Следовательно, наши данные не подтверждают предшествующей точки зрения, согласно которой LNT является предпочтительным субстратом для микробиоты.

В целом, в желудочно-кишечный тракт ребенка, получающего грудное молоко, попадают большие количества ОГМ, то есть, несколько граммов в день. Примерно 1–5% ОГМ, по всей видимости, выводится с мочой [19, 28, 29, 31, 36]. При определении количества отдельных ОГМ в моче, можно обнаружить примерно 50–160 мг LNT или LNFP II, что является четким показателем предшествующего всасывания ОГМ [30].

Следовательно, в крови ребенка циркулируют несколько сот миллиграмм ОГМ в день. В этой связи можно ожидать, что ОГМ могут вызывать не только местные, но и системные эффекты.

Представленные данные ставят на повестку дня вопрос о том, что имеется в виду, когда грудное молоко считают «золотым стандартом», если рассматривать понятие стандарта применительно к составу ОГМ. Существуют значительные различия по общему количеству и профилю отдельных ОГМ, что может быть обусловлено генетикой матери. Является ли качество грудного молока более низким, если в нем отсутствуют определенные ОГМ, как в случае с несекреторами, к которым относится примерно 20% популяции? Заслуживают ли дети матерей-несекреторов особого внимания, если предположить, что они могут подвергаться более высокому риску развития определенных заболеваний? Следовательно, может быть задача заключается не только в выявлении ОГМ с самыми выраженными полезными эффектами для большинства детей первого года жизни, но также в том, чтобы определить риск (с точки зрения поддержания здоровья/развития болезни) для детей первого года жизни на основании зрелости/незрелости на момент рождения, а также установить их генетические характеристики, для получения максимально возможной пользы от обогащения питания за счет добавления ОГМ.

Конфликт интересов отсутствует.