К.Д.Ермоленко^1,2, О.С.Доготарь³, Н.В.Скрипченко^1,4

¹Детский научно-клинический центр инфекционных болезней Федерального медико-биологического агентства России, Санкт-Петербург, Российская Федерация;

²Санкт-Петербургский государственный университет, Санкт-Петербург, Российская Федерация;

³ООО «Нестле Россия», Москва, Российская Федерация;

⁴Санкт-Петербургский государственный педиатрический медицинский университет, Санкт-Петербург, Российская Федерация

Контактная информация:

Ермоленко Константин Дмитриевич, кандидат медицинских наук, руководитель отдела острых кишечных инфекций Детского научноклинического центра инфекционных болезней Федерального медикобиологического агентства России

Адрес: Россия, 197022, г. СанктПетербург, ул. Профессора Попова, 9

Статья поступила 26.11.2024, принята к печати 25.12.2024

Статья представляет собой современный обзор литературы, посвященной феномену колонизационной резистент ности у детей, ее становлению и поддержанию, факторам, влияющим на ее адекватное формирование. Сохранение грудного вскармливания представляется важной стратегией, так как отдельные компоненты грудного молока прини мают активное участие в формировании колонизационной резистентности. Особая роль принадлежит олигосахари дам грудного молока (ОГМ). Известно, что они выполняют ряд полезных физиологических функций, включая создание и поддержание здорового микробиома кишечника, развитие иммунной системы и модуляцию воспалительных реак ций, укрепление кишечного барьера и защиты от инфекционных заболеваний. Понимание механизмов функциональ ных эффектов ОГМ может лежать в основе профилактики различных заболеваний и состояний у детей.

Эволюционное развитие человека и млекопитающих происходило под постоянным воздействием сообщест ва симбиотических, комменсальных и некоторых потенци ально патогенных микроорганизмов. Многообразие бакте рий, простейших, грибов и вирусов в желудочнокишечном тракте (ЖКТ) человека формирует относительно стабиль ное сообщество, которое противостоит вторжению чужерод ных микроорганизмов, образуя один из ключевых элементов «колонизационной резистентности» [1].

Физиологический феномен колонизационной резистент ности основан на способности взаимодействующих друг с другом микробиоты и макроорганизма защищать экоси стему слизистых оболочек от патогенных микроорганизмов. Комплекс включает местные факторы, к которым принад лежат ингибиторы микробной адгезии, секреты слюны, желчи, желудочного и кишечного содержимого (антимикроб ный эффект), состав и количество муцина, pH среды, нор мальная микробиота, механические факторы (мерцатель ный эпителий, целостность слизистых, скорость обновления эпителия, перистальтика кишечника), врожденный и адап тивный иммунитет [2]. В данном обзоре представлены со временные данные о некоторых факторах, влияющих на формирование колонизационной резистентности у детей.

Колонизация желудочно-кишечного тракта у детей

Развитие кишечной микробиоты (КМБ) детей представля ет собой последовательный процесс, который начинается внутриутробно, длится примерно до трехлетнего возраста ребенка [3] и зависит от многих факторов [4, 5]. Кишечник новорожденных первыми колонизируют факультативные анаэробы, такие как Escherichia coli и Streptococcus spp., которые создают оптимальную среду для последующей ко лонизации облигатными анаэробами (Bacteroides spp., Bifidobacterium spp. и Clostridium spp.) [6]. При этом дети, родившиеся через естественные родовые пути, подвергают ся воздействию микробиоты матери, что представляет собой, по мнению некоторых ученых, недооцененную форму наследственности, и в составе их микробиоты преобладают Lactobacillus, Prevotella. В то же время у детей, рожденных путем операции кесарева сечения, состав КМБ сходен с ми кро биотой кожи матери, где преобладают Staphylococcus, Corynebacterium и Propionibacterium spp. [7]. Бифидобакте рии колонизируют кишечник в течение первых нескольких дней после родов [8]. В первые 1–2 года жизни ребенка соста в КМБ здоровых детей на грудном вскармливании (ГВ) обычно отличается относительно низким микробным разно образием при одновременно высоком относительном содер жании бифидобактерий «младенческого» типа, включая Bifidobacterium longum subsp. infantis, B. bifidum, B. breve и B. longum subsp. longum [9]. У детей на искусственном вскармливании (ИВ) в составе КМБ наблюдается большее разнообразие и более высокая распространенность B. adolescentis, B. catenulatum, Bacteroides, Proteus и Clostridium [7]. Отличия в составе кишечной микробиоты детей на ИВ и ГВ были замечены уже более 100 лет назад. Путь, который прошли ученые разных стран и специальностей, пытаясь поня ть, с чем это связано, вызывает уважение. Было обна ружено, что отличия во многом связаны с наличием неизвестной углеводной фракции в составе грудного молока. Ей присваивались разные названия: «gynolactose», «бифи дусфактор», и позднее стало понятно, что это не что иное, как олигосахариды грудного молока (ОГМ), имеющие уни кальную структуру, содержащие, кроме лактозного ядра такие компоненты, как Nацетилглюкозамин, фукозу, сиало вую кислоту, имеющие различную пространственную кон фигурацию, что и определяет их положительное влияние на различные аспекты здоровья ребенка [10].

Предполагаемые механизмы колонизационной резистентности

Организм как ребенка, так и взрослого постоянно под вергается воздействию кишечных патогенов, однако забо левания развиваются далеко не всегда. Колонизационная резистентность предполагает существование множества уровней защиты организма, включая прямое взаимодей ствие между микроорганизмами и косвенные механизмы, опосредованные стимуляцией микробиотой иммунной си стемы слизистых оболочек. Такие взаимодействия, вероят но, развились в процессе эволюции для поддержания здоро вья и гомеостаза в целом и, как следствие, обеспечивают преимущества для выживания как макроорганизма, так и представителей микробиоты [11].

Прямое взаимодействие между микроорганизмами

Ингибирование роста патогенов комменсальными бакте риями было продемонстрировано ex vivo (т.е. при отсутствии иммунных реакций хозяина) и in vivo, показывая, что прямые взаимодействия микроорганизм—микроорганизм являются важным компонентом устойчивости к колонизации. Суще ствует ряд механизмов, с помощью которых эти взаимо действия могут подавлять колонизацию ЖКТ патогенными микроорганизмами: конкуренция за ниши и питательные вещества, метаболическая активность КМБ [11].

1. Конкуренция за ниши и питательные вещества

Здоровая КМБ характеризуется разнообразным и много численным сообществом, заполняет широкий спектр доступных ниш, образуя сложные питательные сети, где побочный продукт метаболизма одного микроорганизма является субстратом для роста другого. Доступность питательных веществ существенно влияет на разнообразие и обилие микроорганизмов, которые колонизируют кишечник. Любая вторгшаяся чужеродная бактерия вступает в прямую конку ренцию с комменсальной микробиотой за ниши и питательные вещества. R.Maltby et al. продемонстрировали, что два комменсальных штамма E. coli (E. coli HS и E. coli Nissle 1917) могут предотвращать колонизацию кишечника E. coli O157:H7 посредством конкуренции за питательные вещества. Каждый кишечный комменсальный штамм обладает определенной для него способностью использовать питательные вещества, и существует высокая конкуренция между бактериями с перекрывающимися способностями использовать эти вещества. В процессе этой борьбы патогенным микроорганизмам легче заселить кишечник с низким разнообразием кишечной микробиоты, которая не использует все доступные питательные вещества (например, после лечения антибиотиками). За какие субстраты разворачивается борьба? Как правило, бактерии конкурируют за источники углерода и азота, и также за железо и цинк. Теория ниши питательных веществ была впервые описана Rolf Freter в 1983 г., когда он предположил, что состав КМБ определяется доступностью питательных веществ: микроорганизм будет колонизировать кишечник только в том случае, если сможет использовать одно или несколько ограничивающих питательных веществ с большей эффективностью, чем его конкуренты. Поэтому если ниши заняты комменсалами, использующими все доступные питательные компоненты, патогенным микроорганизмам сложнее заселить кишечник [12].

Моносахариды, дисахариды и большинство белков, попадающих в организм человека, перевариваются и всасываются в тонком кишечнике. В результате в толстом кишечнике остаются только сложные растительные полисахариды и выделяемая хозяином слизь, которые служат источником пищи для многочисленного сообщества бактерий. Некоторые бактерии, которые преобладают в толстом кишечнике, такие как Bacteroides, обладают широким спектром генов, отвечающих за утилизацию полисахаридов. Другие, такие как патогенные энтеробактерии, как правило, могут использовать только простые сахара и аминокислоты для удовлетворения своих потребностей в углероде, азоте и энергии, и их содержание в здоровом кишечнике невелико. Повышенное содержание сахара и свободных аминокислот, доступных после лечения антибиотиками, может быть использовано Clostridium difficile, вызывающими псевдомембранозный колит. Диета может оказывать глубокое воздействие на состав и функции микробиоты и, следовательно, на устойчивость к колонизации. Сложные растительные полисахариды, содержащиеся в рационе взрослых, являются основным источником пищи для анаэробных бактерий, которые преобладают в нижних отделах ЖКТ. Исключение из рациона таких полисахаридов приводит к изменению общей структуры сообщества и со временем может привести к необратимой потере видов в кишечнике. Потеря защитных видов или нарушение их нормальных функций в отсутствие предпочи таемыхими источников пищи может привести к снижению устойчивости к колонизации. Например, при недостатке в рационе полисахаридов бактерии переключают пищевые предпочтения в сторону слизистых гликанов и белков, разрушая их, снижая эффективность этого защитного механизма и усиливая тем самым повреждающий эффект, наносимый Citrobacter rodentium. Рацион, не содержащий полисахаридов, также способствует более легкой инвазии C. difficile [1]. В рационе детей полисахариды появятся в питании не сразу, а только с момента введения прикорма, поэтому до этого момента именно содержание в грудном молоке олигосахаридов является одним из важных факторов, определяющих состав КМБ ребенка. ОГМ являются основным пищевым субстратом и избирательно утилизируют ся преимущественно Bifidobacterium, которые составляют ~90% состава КМБ у детей на ГВ и, по всей вероятности, принимают самое активное участие в формировании колонизационной резистентности. Дело в том, что они обладают набором генов, кодирующих синтез специфических ферментов (гликозилгидролаз), необходимых для внутриклеточной (B. infantis, B. breve, B. longum) или внеклеточной (B. bifidum, B. longum) ферментации ОГМ. Эти «младенческие» бифидобактерии секретируют широкий диапазон гидролаз: αсиа лидазу, αфукозидазу, βгалактозидазы, βNацетил гексо за минидазы и др., что позволяет ферментировать почти все ОГМ, включая 3’SL, 6’SL, 2’FL, LNT, DFL, LNnT, т.е. представителей всех трех классов ОГМ: фукозилированных нейтральных, нефукозилированных нейтральных, кислых сиалилированных. Если в ГМ фукозилированные ОГМ отсутствуют либо содержатся в низкой концентрации, КМБ детей характеризуется преобладанием Clostridiales и Enterobacterales, и эти дети имеют более высокий риск диареи, вызванной Campylobacter. Учитывая важность влияния ОГМ на состав КМБ, для детей, находящихся на ИВ, в настоящее время в состав детских молочных смесей вводят олигосахариды, структурно идентичные ОГМ. В рандомизированном контролируемом двойном слепом многоцентровом клиническом исследовании, опубликованном в 2020 г., было проде монстрировано, что у детей после трехмесячного приема детской молочной смеси NAN^® Supreme с двумя ОГМ — 2’FL и LNnT (основная группа) — значительно увеличилось количество бифидобактерий и уменьшилось количество Escherichia и неклассифицированных Peptostreptococcaceae (исследование с помощью секвенирования гена 16S рРНК), состав КМБ приближался к составу микробиоты у детей на ГВ и отличался от КМБ у детей контрольной группы, получавших детскую молочную смесь без ОГМ. Добавление ОГМ привело к тому, что профиль микробиоты, наблюдаемый у детей, родившихся путем кесарева сечения, приблизился к профилю, наблюдаемому у детей контрольной группы, родившихся естественным путем, что говорит о положительном влиянии ОГМ на состав КМБ у детей, рожденных оперативным путем [10].

2. Метаболическая активность кишечной микробиоты

Внутренняя метаболическая активность комменсальной микробиоты создает в кишечнике условия, которые могут подавлять рост и экспрессию генов вирулентности вторгшихся патогенов. Кишечная микробиота ферментирует полисахариды, а у детей, находящихся на ГВ, ферментирует ОГМ с образованием короткоцепочечных жирных кислот (КЦЖК). Ацетат, лактат (у детей), пропионат и бутират являются наиболее распространенными из них, валерат присутствует в меньших концентрациях. Неионизированные КЦЖК могут проникать через мембрану бактерий в цитоплазму, где распадаются на ионизированные формы, снижая внутриклеточный рН и подавляя рост чувствительных бактерий, в т.ч. устойчивых к антибиотикам Enterobacteriaceae [12]. КЦЖК могут действовать как ингибиторы экспрессии генов вирулентности патогенных энтеробактерий. Например, воздействие бутирата на Salmonella enterica снижает экспрессию генов вирулентности и снижает его способность проникать в клетки хозяина или индуцировать апоптоз, что является ключевым первым шагом, который Salmonella spp. используют для индуцирования воспаления кишечника и проникновения в более глубокие ткани [11].

Как известно, снижение рН является биологической стратегией, направленной на ограничение роста патогенных бактерий. Это естественное предотвращение инвазии патогенов путем снижения рН и подкисления среды является одной из важных стратегий, с помощью которой бактериальные сообщества, населяющие кишечник, защищают организм хозяина от проникновения патогенов [13, 14]. Большинство условнопатогенных бактерий предпочитают расти при рН, приближающемся к нейтральному (рН 6,0— 7,0), и плохо растут в кислых условиях (рН ≤5,5). Уровень рН микробной экосистемы в значительной степени определяется метаболитами, вырабатываемыми ее обитателями. Молочнокислые бактерии (например, Bifidobacterium и Lactobacillus) продуцируют уксусную (ацетат) и молочную (лактат) кислоты в качестве основных конечных продуктов метаболизма, что, в свою очередь, значительно снижает рН просвета кишечника. Сниженный pH толстой кишки замедляет скорость роста и экспрессию генов вирулентности патогенных микроорганизмов семейства Enterobacteriaceae [11]. Лактат вызывает локальное снижение рН до уровней ниже оптимальных для кишечных патогенов, таких как Salmonella spp. и E. coli O157, подавляя скорость их репликации in vivo [11]. Например, введение детям коммен салов, продуцирующих КЦЖК, таких как B. longum subsp. infantis, снижает рН кишечника с 5,97 до 5,15 и снижает содержание генов фактора вирулентности [15–17]. Еще в 1926 г. появились данные о том, что рН стула здоровых новорожденных, находящихся на ГВ, составляет в среднем 4,88, но у младенцев, которых не кормили грудным молоком, рН стула был ближе к 6,0. Более чем 20 лет спустя, в 1955 г., было обнаружено, что рН стула детей, находящихся на ГВ, составляет от 5,3 до 5,5. На сегодняшний день, согласно исследованиям, типичный уровень рН кала у младенцев, независимо от типа вскармливания, достигает 6,5, что соответствует увеличению почти на две единицы по сравнению с 1926 г. В совокупности эти данные свидетельствуют о том, что за последнее столетие рН кала младенцев значительно повысился, что соответствует снижению частоты ГВ и уменьшению количества бифидобактерий в составе КМБ. Стоит отметить, что аналитические методы, используемые для измерения pH, практически не изменились, что позволяет напрямую сравнивать исторические и современные данные. Интересно, что изменения рН кала у младенцев происходили преимущественно в промышленно развитых регионах, таких как Соединенные Штаты и Европа. И наоборот, в менее промышленно развитых странах, где уровень ГВ остается высоким, а вмешательства, изменяющие микробиом, менее распространены (например, ограниченное применение антибиотиков и низкий уровень оперативных родов путем кесарева сечения), бифидобактерии доминируют в микробиоме младенцев, причем доминирующим видом является B. longum subsp. infantis (B. infantis). В КМБ младенцев из промыш ленно развитых стран снижается уровень бифидобактерий, в частности B. infantis. Предполагается, что такая видоспецифичная утрата B. infantis отчасти является следствием его элиминации из материнской кишечной микробиоты в результате многократного использования антибиотиков и других факторов, оказывающих отрицательное воздействие на микробиом. В целом данные указывают на потерю популяции B. infantis в течение последнего столетия, когда одновременно наблюдался значительный рост аутоиммунных и аллергических заболеваний. Важные экосистемные функции микробиома могут быть утрачены при отсутствии доминирования бифидобактерий, что, в свою очередь, приведет к низкой стабильности сообщества и снижению колонизационной резистентности. КМБ младенцев, рожденных сегодня в большинстве промышленно развитых стран, свидетельствуют о низкой стабильности сообщества и содержат большое количество потенциальных патогенов в первые месяцы жизни. У детей на грудном вскармливании механизм, благодаря которому B. infantis становится доминирующим в кишечнике, снижает рН и обеспечивает колонизационную резистентность, заключается в его уникальной способности метаболизировать все ОГМ до конечных продуктов, главным образом лактата и ацетата. B. infantis — единственный известный представитель КМБ, способный потреблять все типы ОГМ, содержащиеся в грудном молоке, благодаря своей уникальной генетической структуре. Если не вырабатывается достаточного уровня ацетата и лактата, рН толстой кишки остается высоким и больше не обеспечивает устойчивость кишечника младенца к колонизации [16, 18]. Когортные исследования показывают, что отсутствие колонизационной резистентности и последующее повышение рН в кишечнике младенцев, находящихся на ГВ, приводят к повышению уровня потенциально вирулентных патогенов [15], увеличению генной нагрузки, устойчивой к антибиотикам [19], и хроническому воспалению кишечника в течение первых месяцев жизни, что может быть связано с повышенной распространенностью аутоиммунных заболеваний. Низкий уровень рН является ключевым фактором устойчивости к колонизации в кишечнике ребенка, обеспечивающий устойчивость к инвазии условнопатогенных микроорганизмов [18].

Метаболическая активность комменсальной микробиоты также снижает уровень свободного кислорода в просвете кишечника, что приводит к созданию преимущественно анаэробных условий в ЖКТ. Доступный кислород является ключевым сигналом и ресурсом для бактерий, и благодаря метаболическим сетям в кишечной микробиоте его присутствие может оказывать глубокое влияние на весь состав микробиоты и активность определенных групп бактерий. Некоторые из наиболее важных кишечных патогенов, такие как Enterobacteriaceae, являются факультативными анаэробами (могут выживать в аэробных и анаэробных средах), что позволяет им легко выживать как в окружающей среде (т.е. во время передачи инфекции), так и в ЖКТ. Например, Shigella flexneri улавливает небольшие различия в доступном кислороде в кишечнике и при определенных условиях экспрессирует свои факторы вирулентности для влияния на эпителиальные клетки, что приводит к воспалению. Следовательно, способность комменсальной микробиоты поддерживать в значительной степени анаэробную среду в кишечнике ограничивает вирулентный потенциал многих важных патогенов. Комменсальная микробиота также обладает целым арсеналом соединений, которые могут быть использованы для непосредственной борьбы с микробами конкурентами, например бактериоцины. Это широкий спектр пептидов, которые выделяются бактериальными клетками и могут обладать бактерицидной активностью как узкого, так и широкого спектра действия против конкурирующих микроорганизмов, например, таких патогенов, как Listeria monocytogenes, Salmonella spp., Clostridium botulinum, Clostridium perfringens и C. difficile [11].

Другие микробные метаболиты могут стимулировать или подавлять рост некоторых патогенных микроорганизмов, которые колонизируют кишечник. Соли желчных кислот играют важную роль в стимулировании прорастания спор C. difficile или ингибировании вегетативных клеток [12]. Гидролаза желчных солей — это фермент, вырабатываемый некоторыми кишечными комменсалами (такими, как пред ставители родов Bacteroides, Bifidobacterium и Faecali bacterium), который расщепляет конъюгированные первичные желчные кислоты, включая таурохолат. Таурохолат способствует прорастанию спор C. difficile, что приводит к колонизации C. difficile в кишечнике [12]. Некоторые кишечные комменсалы (такие как Clostridium scindens) продуцируют ферменты, участвующие в 7α-дегидроксилазном пути, которые участвуют в превращении неконъюгированных первичных желчных кислот во вторичные, такие как дезоксихолат и литохолат. Эти вторичные желчные кислоты могут подавлять вегетативный рост C. difficile. Т.е. в то время, как первичные желчные кислоты способствуют прорастанию спор, вторичные желчные кислоты ингибируют спорообразование C. difficille. Таким образом, здоровая кишечная микробиота способствует устойчивости к колонизации C. difficile за счет метаболизма желчных кислот [12].

Косвенные механизмы колонизационной резистентности

Кишечные бактерии и продукты их метаболизма являются мощными стимуляторами иммунной системы кишечника и непосредственно влияют на состояние эпителиальных клеток кишечника, а также на состав и активность клеток иммунной системы [11]. 100 дней жизни — критический период для развития иммунной системы [17, 20]. 70% иммунной системы связано с кишечником, и в первые месяцы жизни формируются паттерны, связанные с распознаванием «я» и «не-я», с последствиями на всю жизнь [17]. Интересно, что наряду с потерей устойчивости к колонизации в кишечнике младенцев за последние 100 лет в промышленно развитых странах наблюдается резкий рост аутоиммунных заболеваний (например, астмы, атопического дерматита, пищевой аллергии, диабета I типа и т.д.). Хотя существует соблазн установить причинноследственную закономерность в этой связи, до сих пор не проводилось рандомизированных контролируемых исследований, чтобы установить, может ли восстановление колонизационной резистентности на ранних стадиях жизни младенца повлиять на развитие аутоиммунных заболеваний в более позднем возрасте. Однако повышенное количество биомаркеров, связанных с развитием аллергических и аутоиммунных состояний и изменением реакции на вакцинацию [21] у младенцев с низким содержанием бифидобактерий в микробиоме, свидетельствует о вероятной связи между снижением колонизационной резистентности и нарушением развития иммунной системы [22].

Баланс Т-клеток

Наличие специфических групп Т-клеток в собственной пластинке важно для формирования и поддержания колони зационной резистентности. Сбалансированный статус регу ляторных Т-клеток / Т-хелперов 17-го типа (Treg/Th17) является признаком кишечного гомеостаза. Регуляторные Тклетки (Tregs; CD4⁺ CD25⁺ Foxp3⁺ ), расположенные в собственной пластинке кишечника, подавляют патологические воспалительные реакции через опосредованные интерлей кином-10 (IL-10) сигнальные каскады, особенно те, которые связаны с чрезмерной активностью эффекторных Т-клеток. В настоящее время известно, что эволюционно различные группы комменсальных бактерий индуцируют размножение Tregs из наивных Th-клеток и, как следствие, защищают от сильного воспаления и повреждения слизистой оболочки, вызванного кишечными патогенами. Например, специфические бактерии, такие как Bacteroides fragilis и B. infantis, способствуют размножению Treg-клеток и укрепляют кишечный барьер с помощью различных механизмов. Существуют более общие продукты жизнедеятельности кишечной микробиоты, например АТФ, которые способствуют развитию и привлечению клеток Th17 в собственную пластинку, что связано с устойчивостью к экспериментальному колиту. Тот факт, что физиологически и биохимически разнообразные комменсальные бактерии и их метаболиты способствуют сохранению взаимовыгодных отношений с хозяином, подчеркивает эволюционную адаптацию, которая приносит пользу хозяину и этим микроорганизмам [11]. У детей при рождении наблюдается дисбаланс между Th1/17 и Th2 в по пуляциях иммунных клеток и избыточная экспрессия маркеров воспаления. Предполагается, что ОГМ благоприятно модулируют врожденные иммунные реакции новорожденных, контролируя экспрессию маркеров воспаления, влияя на работу цитокинов, которые регулируют баланс Th1/Th2 лимфоцитов. ОГМ могут модулировать иммунный ответ новорожденных косвенно, изменяя состав КМБ и ее метаболитов, а также напрямую, влияя на реакции эпителия и иммунных клеток в кишечнике или системный иммунный ответ. Согласно исследованиям, ОГМ модулируют межклеточные взаимодействия иммунной системы, тем самым способствуя поддержанию сбалансированных воспалительных клеточных реакций. ОГМ снижают уровни провоспалительных цитокинов (IL-1β, IL-6 и IL-8), одновременно стимулируют экспрессию цитокинов, связанных с восстановлением тканей и гомеостазом. ОГМ повышают экспрессию поляриза ции Th1 и смещают баланс цитокинов Th1/Th2, стимулируют дендритные клетки, что связано с повышенными уровнями противовоспалительных цитокинов (IL-10 и IL-20), снижают индуцированную липополисахаридом (LPS) продукцию про воспалительных цитокинов, таких как IL-12p70 и фактор некроза опухоли-α (TNF-α ), предотвращая взаимодействие LPS и TLR4. W.Zhang et al. показали, что некоторые ОГМ влияют на воспалительные процессы популяции клеток через ядер ный фактор (NF)-κB и митогенактивируемые протеинкиназ ные пути. Противовоспалительные эффекты 2’FL были про демонстрированы в клетках кишечного эпителия, в которых 2’FL подавляет LPS-индуцированное воспаление во время инфицирования эпителиальных клеток кишечника штаммами E. coli. Присутствие 2’FL снижает экспрессию CD14, фактора, который опосредует взаимодействие LPS и TLR4. В исследовании 2010 г. воздействие сиалилированных ОГМ способствовало выработке интерферонаγ (IFN-γ) и IL-10, что приводило к смещению иммунного ответа в сторону более сбалансированного профиля Th1/Th2. Противовоспалительные эффекты 3’SL были подтверждены в ходе исследования клеток Caco-2 in vitro, где воздействие 3’SL приводило к снижению экспрессии IL-8, IL-12 и TNF-α [10]. Оказывая прямое влияние на функции иммунокомпетентных клеток и опосредованное, через улучшение состава кишечной микробиоты, ОГМ способны внести неоценимый вклад в формирование колонизационной резистентности.

Влияние на эпителиальный слой

Взаимодействие между кишечным эпителием и коммен сальной микробиотой имеет решающее значение для установления гомеостаза в кишечнике и устойчивости к колони зации. Toll-подобные рецепторы (TLR) и нуклеотидсвязыва ющие олигомеризационные доменоподобные рецепторы (NODs) являются ключевыми рецепторами макроорганизма. Эти рецепторы стратегически важно расположены на различных поверхностях клетокхозяев, внутри определенных органелл и цитоплазмы для распознавания множества кишечных микроорганизмов и продуктов их жизнедеятельности, таких как липополисахариды, пептидогликаны, нуклеотиды, белки и липопротеины. Взаимодействия TLR и ком менсальных микробов поддерживают устойчивый гомеостаз слизистой оболочки кишечника, а TLR/NODs играют центральную роль в распознавании патогенов и их повреждаю щей активности, инициирующей защиту организма и воспаление. Примечательно, что TLR-распознавание специфических комменсальных бактерий индуцирует врожденную антимикробную активность, которая может специфически воздействовать на S. enterica и ограничивать системную инвазию. То, как система TLR проводит различие между комменсальными и патогенными бактериями, остается на сегодняшний день не до конца понятным [11].

Влияние КЦЖК и ОГМ на состояние эпителиальных клеток кишечника

КЦЖК играют важную роль в поддержании здоровья слизистых оболочек и устранении патологии в кишечнике. Бутират и валерат повышают барьерную функцию кишечника, которая предотвращает попадание патогенных микроорганизмов из кишечника в кровоток [12]. Бутират является основным источником энергии для энтероцитов и, таким образом, косвенно способствует укреплению барьерных функций эпителия. Кроме того, бутират взаимодействует с эпителиальными клетками кишечника, влияет на доступность кислорода. При снижении содержания бутирата на фоне лечения антибиотиками доступность кислорода увеличивается, что способствует росту факультативноанаэробных патогенов [12]. Ацетат и пропионат обнаруживаются в крови, что указывает на связь между КМБ, общим состоянием организма и гомеостазом. Эксперименты показали, что выработка ацетата бифидобактериями защищает мышей от энтерогеморрагической инфекции, вызванной кишечной палочкой, за счет уменьшения транслокации токсина (Shiga toxin) из кишечника в кровь. Maslowski et al. про демонстрировали, что КЦЖК передают сигнал через Gбелки (GPR43), присутствующие на лейкоцитах, таких как нейтрофилы, для инициирования сигнального каскада, при водящего к стимуляции клеточной миграции и апоптоза. Авторы предполагают, что КЦЖК играют важную роль в устранении воспаления кишечника, подавляя повреждающее действие нейтрофилов [11].

ОГМ также вносят свой вклад в укрепление кишечного барьера, способствуя повышению колонизационной резистентности. Они способствуют увеличению экспрессии белков плотных контактов и усиливают дифференцировку вдоль оси ворсинка—крипта. 2’FL, 3’FL и 6’SL, DFL, LNnT отдельно или в комбинации могут увеличивать дифференцировку кишечных эпителиальных клеток и способствовать созреванию кишечного эпителия [23], снижению проницаемости эпителиального барьера. 2’FL, 3’FL стимулируют выработку муцина, образование гликокаликса. 3’SL, DFL обладают противовоспалительным действием за счет снижения экспрессии IL-12 и IL-8 в клетках. Эти эффекты были также связаны с изменением состава КМБ, повышением численности комменсальных бактерий и повышенным уровнем пропионата в кишечнике. Таким образом, ОГМ способны модулировать состояние кишечного барьера, непосредственно влияя на все его компоненты [24].

Антиадгезивные и антимикробные свойства ОГМ

Многие вирусы и бактерии должны взаимодействовать с рецепторами эпителиальных клеток для реализации своего патогенного потенциала. ОГМ из-за схожести с этими рецепторами способны выступать в качестве «точек прикрепления» для патогенов, имитируя рецепторы на поверхности эпителиальных клеток. Таким образом, патогены уже не способны прикрепляться к поверхности клеток и выводятся из организма, что значимо снижает риск развития того или иного заболевания [25]. ОГМ также могут изменять экспрессию гликанов [26]. Было показано, что в культуре клеток Caco-2 клетки эпителия изменяют свой поверхностный гликановый профиль после воздействия 3’SL, следовательно, уменьшается способность некоторых патогенов к адгезии. Список патогенов, в отношении которых ОГМ способны оказывать блокирующее действие, очень широк и зависит от структурных особенностей конкретных ОГМ. 2’FL способ на блокировать Campylobacter jejuni, энтеропатогенные E. coli, S. enterica, Rotavirus, Norovirus, Human respiratory syncytial virus; 3’FL — энтеропатогенные E. coli, S. enterica, Norovirus; LNT — Vibrio cholerae, стрептококки группы B (GBS), Entamoeba histolytica; 3’SL — энтеропатогенные E. coli, V. cholerae toxin, Helicobacter pylori, Pseudomonas aeruginosa, Rotavirus, Influenza virus; 6’SL — энтеропатогенные E. coli, H. pylori, P. aeruginosa, Influenza A H1N1, Rotavirus; LNnT — пневмококки, Influenza virus [27]. ОГМ демонстрируют высокую эффективность в блокировке рецепторовлектинов, которые обуславливают вирулентность P. aeruginosa. Экспериментальные исследования показали, что 2’FL ослабляет инвазию C. jejuni на 80% и уменьшает число эпизодов диареи, связанных с данным патогеном [26]. E.Jantscher-Krenn et al. в ходе исследований in vitro продемонстрировали, что ОГМ снижают цитотоксичность и адгезию E. histolytica к эпителиальным клеткам кишечника. Сиалилированные ОГМ (3’SL и 6’SL) вызывают снижение уровня инфицирования гриппом в исследованиях клеточных культур. 3’FL и 2’FL способны связывать норовирус [28]. ОГМ обладают бактериостатическим действием в отношении GBS. В экспериментальных работах показана способность LNT и LNDFH-I задерживать рост GBS на 96–98%. ОГМ продемонстрировали антибактериальное действие в отношении Acinetobacter baumannii и Staphylococcus aureus [29]. У новорожденных ОГМ изменяют рост и морфогенез Candida albicans, что затрудняет прикрепление, инвазию и развитие заболевания [30]. Таким образом, ОГМ принимают активное непосредственное участие в формировании колонизационной резистентности.

Преодоление колонизационной резистентности патогенами

Кишечные патогены могут нарушать состав здоровой КМБ, взаимодействуя с поверхностью слизистой оболочки, ослабляя барьерную функцию и вызывая воспаление, которое, как правило, приводит к развитию нарушения стула, диарее. Это сопровождается распространением патогенов в окружающей среде, повышая вероятность заражения другого восприимчивого хозяина, что составляет стратегию распространения микроорганизмов. Различные патогены используют множество факторов вирулентности для колонизации клетокхозяев и развития воспаления, так как выработали ряд механизмов выживания и процветания в условиях вос палительной среды, например, Salmonella Typhimurium и C. rodentium. А распознавание этих микроорганизмов, опосредованное TLR/NOD, запускает реакцию Th1/Th17, которая характеризуется привлечением макрофагов и нейтрофилов. Напротив, многие комменсальные бактерии не могут выжить в условиях воспаления, и, как следствие, разнообразие комменсальной микробиоты снижается. Поэтому S. Typhimurium и C. rodentium используют сильную патологическую Th1/Th17 опосредованную воспалительную реакцию, чтобы вытеснить полезных комменсалов. Лечение антибиотиками нарушает состав КМБ, это приводит к значимому сокращению численности микроорганизмов, их видового разнообразия и подавлению врожденной иммунной системы. Воздействие антибиотиков снижает устойчивость к колонизации, освобождая ниши и питательные вещества и создавая иммуносупрессивное состояние организмахозяина для использования вторгающимися патогенами. Действительно, некоторые патогенные микроорганизмы эволюционировали, чтобы специально использовать антибиотики. Например, C. difficile является основной причиной диареи, связанной с приемом антибиотиков. C. difficile продуцирует два мощных энтеротоксина, обладающих активностью глюкозилтрансферазы, которые проникают в энтероциты, приводя к необратимому разрушению актинового цитоскелета. Клеточная интоксикация может привести к гибели клеток и нарушению барьерной функции [11].

Антибиотики нарушают колонизационную резистентность, опосредованную микробиотой, способствуя колонизации и размножению патогенных микроорганизмов в кишечнике. Антибиотики широкого спектра действия приводят к значительному снижению численности и разнообразия широкого спектра кишечных комменсалов, тем самым снижая конкуренцию за питательные вещества [12]. Эти кишечные ниши, определенные питательными веществами, затем могут быть использованы патогенами, такими как C. difficile, карбапенемрезистентными Enterobacteriaceae и S. Typhimurium [31–33]. Лечение антибиотиками также может привести к чрезмерному росту патогенов с множественной лекарственной устойчивостью (МЛУ) в кишечнике. Колонизация кишечника этими МЛУ-патогенами может привести к развитию инвазивных инфекций (таких как инфекции мочевыводящих путей) и может способствовать передаче этих патогенов между пациентами, что представляет особую проблему для пациентов с ослабленным иммунитетом. Восстановление колонизационной резистентности (или предотвращение первоначальной потери колонизационной резистентности) является жизненно важным для ограничения роста МЛУ патогенов в кишечнике после лечения антибиотиками [12]

Возможности повышения колонизационной резистентности

ОГМ оказывают разностороннее положительное влияние на состояние здоровья ребенка, в т.ч. служат пребиотиками, стимулируя рост комменсальных бактерий, преимущественно Bifidobacterium spp., придавая им избирательное преимущество перед патогенами и обеспечивая дополнительную защиту от инфекционных заболеваний. ОГМ служат рецепторамиловушками для предотвращения адгезии патогенов к слизистой оболочке, снижая риск вирусных и бактериальных инфекций. КЦЖК, образующиеся в процессе ферментации ОГМ, укрепляют целостность эпителиального барьера и способны влиять на иммунные реакции. ОГМ укрепляют кишечный барьер, модулируя экспрессию белков плотных контактов, тем самым снижая проницаемость кишечного барьера. ОГМ непосредственно влияют на иммунную функцию посредством модуляции дендритных клеток. Кроме того, благодаря своей уникальной структуре ОГМ способны препятствовать образованию микробных биопленок, что является на сегодняшний день предметом активного изучения, так как открываются возможные перспективы их использования в клинической практике, особенно учитывая, что проблема развития антибиотикорези стентности становится все более острой [34]. Сохранение ГВ является важной стратегией, определяющей состояние здоровья ребенка. И, по всей вероятности, ОГМ принадлежит важная роль в становлении здоровья ребенка в целом и в формировании и поддержании колонизационной резистентности в частности.

В случае, когда ГВ невозможно, у детей на ИВ представляется обоснованным введение олигосахаридов, структурно идентичных ОГМ, в состав детской молочной смеси.

На сегодняшний день в состав детских молочных смесей вводят уже 5 и более олигосахаридов, структурно идентичных ОГМ. Исследования демонстрируют результаты положительного влияния на различные аспекты здоровья детей, в т.ч. механизмы колонизационной резистентности, посредством улучшения состава КМБ, состояния кишечного барьера, антиадгезивного и антимикробного действия, влияния на иммунную систему. В 2022 г. были опубликованы результаты рандомизированного контролируемого двойного слепого исследования [35], проведенного в период с 2018 по 2021 г. в 32 исследовательских центрах Болгарии, Венгрии и Польши. Всего в исследование были включены 4 группы детей (n = 693) в возрасте первых 3 нед. жизни: 2 группы детей на ИВ получали детскую молочную смесь компании Nestlé с 5 ОГМ (2’FL, 3’SL, 6’SL, LNT, и DFL) в количестве 1,5 и 2,5 г/л (группы исследования, тестируемые); третья группа детей получала аналогичную смесь, но без ОГМ (контроль), четвертая группа состояла из детей на ГВ. В начале исследования, через 3 и 6 мес. проводили изучение состава КМБ с использованием метагеномного анализа, определяли уровни секреторного иммуноглобулина А (sIgA), фекального кальпротектина (ФК), α1-анти-трипсина, КЦЖК и рН кала. По результатам проведенных исследований в возрасте детей 3 и 6 мес. было показано, что уровень α- и β-разнообразия КМБ в группах детей, получающих смеси с ОГМ, отличался от состава КМБ детей из контрольной группы и приближался к показателям детей из группы ГВ, причем эти данные относятся как к детям, рожденным естественным путем, так и к детям, рожденным путем операции кесарева сечения. Количество Bifidobacterium (в т.ч. B. infantis) увеличилось в тестируемых группах и было близко к группе ГВ, но снизилось в контроле. Показатели со держания Clostridioides (C. difficile) были сходными в группах ИВ в начале исследования, а через 3 и 6 мес. их относительное содержание в тестируемых группах было на 75–85% ниже, чем в контроле, и сопоставимо с содержанием в группе ГВ. Уровень sIgA в группах с ОГМ был выше, чем в контрольной, и был самым высоким в группе ГВ. Уровни α1-анти-трипсина, ФК, pH кала были ниже в тестируемых группах, чем в контрольной. В контрольной группе была самая низкая концентрация лактата, тогда как в группе ГВ — самая высокая. Относительная доля ацетата в общем количестве КЦЖК через 3 и 6 мес. была ниже в контрольной группе по сравнению с тестовыми группами, что подтверждает положительное влияние ОГМ на состав КМБ, а следовательно, и влияние на количество метаболитов. Таким образом, была показана способность смеси из 5 ОГМ стимулировать «развитие» КМБ у детей на ИВ, увеличивая содержание Bifidobacterium, особенно B. infantis, в т.ч. у детей, рожденных путем кесарева сечения, что подтверждается увеличением концентрации ацетата и лактата, основных конечных продуктов катаболизма бифидобактерий, а также снижением уровня pH. Смесь из 5 ОГМ улучшает иммунный ответ, увеличивая синтез sIgA, а также способствует снижению уровня ФК, маркера воспаления. Таким образом, добавление в детскую молочную смесь комплекса из пяти наиболее важных представителей всех трех категорий ОГМ является оправданным и эффективным способом поддержания оптимального состава КМБ, кишечного барьера и иммунной системы в раннем возрасте у детей, находящихся на ИВ, а также наиболее физиологичной стратегией повышения колонизационной резистентности [35].

Заключение

Феномен колонизационной резистентности сформировался в процессе совместной эволюции человека и огромного сообщества микроорганизмов и призван обеспечить защиту от патогенов посредством взаимодействия комменсальной микробиоты и макроорганизма. У детей важной стратегией правильного формирования колонизационной резистентности и ее поддержания является сохранение грудного вскармливания. Для тех детей раннего возраста, кто по каким-то причинам лишен грудного молока, в настоящее время целесообразно рекомендовать к использованию детских молочных смесей, в состав которых введены олигосахариды, структурно идентичные олигосахаридам грудного молока. Благодаря положительному влиянию ОГМ на состав кишечной микробиоты и ее метаболиты, состояние кишечного барьера, иммунную систему, их антиадгезивного и антимикробного эффектов, более значимой становится роль этих важных компонентов грудного молока в формировании колонизационной резистентности у детей, что определяет перспективы профилактических мероприятий при различных заболеваниях, особенно при инфекционных.

Финансирование: Финансирование данной работы не проводилось.

Конфликт интересов: Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Информация о соавторах:

Доготарь Олеся Сергеевна, научный советник ООО «Нестле Россия»

Скрипченко Наталья Викторовна, доктор медицинских наук, профессор, заместитель директора по научной работе Детского научноклинического центра инфекционных болезней Федерального медикобиологического агентства России, заведующая кафедрой инфекционных заболеваний у детей ФП и ДПО СанктПетербургского государственного педиатрического медицинского университета, заслуженный деятель науки Российской Федерации